RNAi指的是將與目標mRNA對應的正義RNA和反義RNA組成的dsRNA導入細胞,促使mRNA發生特異性的降解,阻礙其在細胞中的進一步翻譯,導致mRNA相對應的基因發生沉默的過程。經過廣泛的研究發現,RNAi在昆蟲中主要涉及siRNA、miRNA和piRNA三種機制[8]。

昆蟲對RNAi的作用機制主要可分為細胞自主作用和非細胞自主作用兩類。在細胞自主的情況下,基因沉默僅在引入dsRNA的組織中可見,RNAi的效率也有限；在非細胞自主RNAi的情況下,在dsRNA吸收位點以外的位置也可以觀察到基因沉默的效果。在昆蟲中,科研人員廣泛研究了非細胞自主RNAi作用,當dsRNA從腸腔被吸收到腸細胞中就可以發揮RNAi沉默作用,此后dsRNA在腸道外細胞中的表達實現了沉默信號的傳播。

基于dsRNA極易引入昆蟲細胞,從而特異性實現RNAi目標,RNAi技術展現出作為生物農藥的巨大潛力。dsRNA可以通過噴灑到受感染的農作物上從而特異性引入昆蟲中,這項技術可視為殺蟲劑使用的替代品,并因其避免了傳統農藥對環境的破壞而廣受歡迎。2023年9月29號,美國EPA擬建議批準Greenlight Bioscience公司防治科羅拉多馬鈴薯甲蟲的產品Ledprona,獲批后,這將是全球第一款直接噴施使用的RNA生物農藥。

RNAi生物農藥的dsRNA遞送策略[9]

此外,在一項將番茄植物根系浸入含有dsRNA溶液的實驗中,觀察到番茄潛葉蛾(Tuta absoluta)有80%的死亡率,這意味著植物韌皮部有效吸收了dsRNA[10]。另外廣泛開展的技術包括使用納米顆粒作為dsRNA穿過昆蟲腸道上皮的載體、利用特異性細菌、病毒來誘導昆蟲的基因沉默及通過農桿菌轉化技術(Agrobacterium-mediated transformation)開發的具有殺蟲作用的轉基因植物等,如拜耳公司的第一款表達昆蟲dsRNA的抗蟲轉基因玉米于2017年獲得美國環境保護署(EPA)的種植許可,2021年獲得中國農業部轉基因安全許可證書。

由上可見,RNA生物農藥具有危害低、可天然降解、普適性強等優點,被譽為繼化學農藥和轉基因農作物之后的第三次生物農藥革命。2024第二屆合成生物學產業嘉年華暨展覽會(SBC2024)將如期舉行并特設″農業和畜牧業″專題論壇。會前,佰傲谷《佰家言》有幸采訪到植生優谷董事長苗雪霞研究員,與她探討RNAi技術運用于農業病蟲害防控的發展狀況及合成生物學在農業領域的廣闊前景和未來趨勢,以下為采訪摘錄。

生物農藥已被證明是綠色低毒環保的新型農藥

1、RNAi生物農藥被稱為農藥史上的第三次革命,您能否簡單介紹下RNAi生物農藥的特點和發展現狀？

苗雪霞：RNAi技術進行病蟲害防治具有防治目標的專一性、靶標開發的便捷性、應用方便易于操作、綠色無污染、無殘留及環境兼容性強等眾多優勢,完全符合公眾對于綠色農藥的需求,因此被稱為農藥史上的第三次革命。

在RNA生物農藥研發領域,目前國外已經有產品上市或準備上市。拜耳公司的第一款表達昆蟲dsRNA的抗蟲轉基因玉米于2017年獲得美國環境保護署(EPA)的種植許可,2021年獲得中國農業部轉基因安全許可證書,截止到2023年12月,已有5款這一類型的產品獲得授權；針對于直接噴灑使用的RNA生物農藥,2023年9月29號,美國EPA擬建議批準Greenlight Bioscience公司防治科羅拉多馬鈴薯甲蟲的產品Ledprona,獲批后,這將是全球第一款直接噴施使用的RNA生物農藥。

2、我們知道RNAi生物農藥有宿主誘導基因沉默(Host-induced gene silencing,HIGS)、噴霧誘導基因沉默(Spraying-induced gene silencing,SIGS)或病毒誘導基因沉默(Virus/bacterium-mediated gene silencing,VIGS)等方式,其實也跟如何施藥和進入病蟲體內相關,在具體應用過程中您覺得這些方法各自的優缺點或者適用范圍有哪些區別？

苗雪霞：針對于HIGS,孟山都公司(現拜耳)的第一款表達昆蟲dsRNA的抗蟲轉基因玉米Mon87411即是屬于該類型。該產品在玉米中同時表達了Bt蛋白,耐除草劑基因,以及針對玉米根螢葉甲Snf7基因的dssnf7。也就是通過轉基因的方式,將昆蟲的dsRNA在植物中表達,昆蟲取食植物后,dsRNA即能夠傳遞到昆蟲體內發揮作用。

Greenlight Bioscience公司的防治科羅拉多馬鈴薯甲蟲的產品Ledprona采用的是SIGS這種方式。dsRNA直接噴灑在有害蟲危害的植物上,一方面,部分噴灑在昆蟲上的dsRNA通過體壁滲透的方式進入昆蟲體內；另一方面,昆蟲取食噴灑有dsRNA的植物后,dsRNA進入到昆蟲的體內并發揮作用。我們公司目前開發的RNA生物農藥屬于該類型。

病毒誘導的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)是指攜帶目標基因片段的病毒侵染植物后,可誘導植物內源基因沉默、引起表型變化,進而根據表型變異研究目標基因的功能。該技術可以用來開發dsRNA 表達和生產系統,在植物體內和體外生產dsRNA,從而發揮作物病蟲害防治的作用。

3、基于目前的田間試驗結果,RNAi生物農藥的安全性如何？包括健康毒理、生態毒理、環境歸趨等風險評估情況。

苗雪霞：RNAi生物農藥的核心成分是核酸,在環境中易降解成核苷酸,并能夠作為原料被生物體利用,因此具有較高的生物安全性。 美國EPA披露的ledprona登記數據中,人類健康、環境歸趨以及生態毒理數據均顯示RNA生物農藥是環境友好的農藥。

我們公司研發的RNA生物農藥針對于意大利蜜蜂、斑馬魚、日本沼蝦的經口急性經口毒性測試表明,該農藥符合國家標準定義的低毒,因此,可以說RNA生物農藥是一款綠色低毒環保型的新型農藥。

4、與傳統農藥相比,RNAi生物農藥在價格及使用上有優勢或者門檻嗎？

苗雪霞：RNA生物農藥的核心有效成分是dsRNA,其生產成本已經降低至1美元/g(Greenlight Bioscience公司數據),我們公司的dsRNA生產成本也已經降至每克幾十元人民幣,并且還有很大的優化和降幅空間。屆時,RNA生物農藥將和傳統農藥的價格相當甚至更低。

植生優谷已構建RNA生物農藥全鏈條研發及生產體系

5、我們知道植生優谷建立了RNA生物農藥全周期開發體系,您從技術的角度跟我們談談公司是如何解決RNA生物農藥的脫靶、作用較慢、易降解、產生抗性等問題的？

苗雪霞：針對于RNA生物農藥的脫靶問題,我們會在選擇靶標基因之前,通過生物信息學的方法,預測可能的脫靶效應,避免選擇可能脫靶的靶標基因。

關于RNA生物農藥發揮作用較慢的問題,不同靶標基因對靶標物種的作用速度不同。某些靶標基因能夠在較短的時間內發揮較好的基因抑制作用,也能夠在較短的時間內對害蟲產生致死作用,從而產生比較理想的防治。因此,靶標基因的選擇也是非常關鍵的。

針對于dsRNA容易降解的問題,可以選擇不同的材料對dsRNA進行修飾或者包埋。比如一些納米材料,具有保護和穩定dsRNA的作用。我們公司基于離子配位螯合技術開發的一種制劑,對dsRNA也有很好的保護作用。不論是在環境中,還是在昆蟲的腸道內,都能對dsRNA起到很好的保護作用,可有效減緩dsRNA的降解。

圖源：植生優谷官網

害蟲對人類開發的任何一種農藥都會產生抗藥性,只是遲早的問題,我們能做的是盡量避免或延緩抗性的產生。例如,昆蟲中有很多基因,都可以作為RNA生物農藥的潛在靶點,我們可以通過更換靶點、或者是在使用早期通過與其他綠色農藥進行混配,延緩并防治害蟲抗藥性的產生。

6、近期,由于ChatGPT火爆出圈,AI制藥又一次引發了人們的高度關注。據了解,植生優谷建立了從基于AI智能算法的大規模靶標基因篩選平臺,能跟我們分享下AI如何促進公司技術研發進程的嗎？

苗雪霞：AI 技術是未來科技競爭中的核心競爭力,我們經過多年研究與數據歸集,初步建立了AI智能化篩選體系,這一系統可以實現快速高效的靶標基因篩選,能夠更快更準確地預測潛在的靶標基因,這為RNAi在農業害蟲中的應用提供了方便。我們知道,農業害蟲中存在大量的未知基因,在現階段還不太可能獲得所有物種基因組信息的情況下,利用AI技術,可以有效節約研發成本和研發周期,節約更多的人力和物力資源。

7、植生優谷獲得了5張農藥″中文通用名″命名函,也在河南新鄉開展了田間試驗,目前公司的生物農藥的研發進展如何？

苗雪霞：由于RNA生物農藥在國內尚無許可上市的先例,想要實現產品最終落地,還有很多工作要做,前期我們與沈陽化工研究院以及農藥命名委員會專家通過多次論證,最終在命名規則方面與命名委員會達成共識,建立了標準化的RNA生物農藥命名規則,目前,我們正在積極推動RNA生物農藥的登記備案工作。

RNA生物農藥在3-5年內將有質的飛躍

8、從產業化的角度,您覺得目前RNAi農藥的挑戰還有哪些？

苗雪霞：RNA生物農藥目前存在的最大挑戰是核心成分dsRNA 的規?；�生產以及制劑配方的標準化體系建立。此外,在政策層面上,目前還沒有針對性的法律法規,這也是導致國內資本對這一領域不夠熱情的重要因素。

因此,想要解決這些問題,需要從國家層面上進行合規認定,加大資本投入,傳統農藥企業也應該看到,隨著農藥產品的逐步更新換代,農藥產品的格局必將改變,RNA生物農藥無疑是我國在生物農藥領域實現趕超國際農化巨頭的一次機會。

9、已有ledprona針對科羅拉多馬鈴薯甲蟲的成功案例在前,您認為國內的第一個RNAi生物農藥大概在什么時候能到來？

苗雪霞：我國有很多科研人員從事RNA生物農藥相關的基礎研究,我們公司也在積極進行RNA生物農藥的開發,并取得了一定的成果,國家以及地方政府也有大量的項目支持RNA生物農藥研發,相關部門也在廣泛征求RNA生物農藥登記的相關建議,相信在未來3~5年,中國的RNA生物農藥將會有一個質的飛躍。

10、RNA技術除了生物農藥,還有哪些運用方向？

苗雪霞：RNAi技術可以作為一種工具進行基因功能研究,通過將dsRNA遞送進入生物體內,就能夠引起靶標mRNA的沉默,進而進行基因功能研究。在植物、動物學研究中,都取得了廣泛的應用。該技術除了用來開發生物農藥外,在提高作物產量和性狀作物品質方面也發揮了重要作用,已經有多款產品獲得上市許可。

RNAi技術在生物醫藥領域具有非常廣闊的應用前景。2018年,Alnylam公司的第一款RNAi藥物獲批上市,隨后幾年,陸續有多款產品獲批上市,并且也實現了從治療罕見病到常見病的飛躍。利用RNAi技術開發生物醫藥,只需要經過簡單的″二維序列設計″識別靶標RNA,就能發揮生理功能。因此,RNAi療法在研發效率、研發成功率、以及可選的靶點范圍上,相比于傳統的藥物,具有很大的優勢。

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